核酸酶传感器 科学家研发新型核酸检测系统，单次材料成本低至约002美元
科学家研发新型核酸检测系统，单次材料成本低至约002美元
近日，上海交通大学王鹏飞教授和团队，设计一种无需预扩增的新型 DNAzyme 传感器，并将其并命名为 SPOT。
图 | 王鹏飞（来源：王鹏飞）
对于以 miRNA 和病毒 RNA 为代表的多种临床意义核酸标记物，本次传感器均具备检测能力，并能实现快速、便捷的临床分子诊断应用。
通过针对血清 miRNA 进行敏感和特异的检测，进而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多种癌症的分子诊断。
此外，SPOT 能从临床拭子中灵敏准确地检测 SARS-CoV-2 RNA。同时，SPOT 可以与侧流层析技术联合，实现对于核酸靶标的即时（POCT，point-of-care testing）检测。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
鉴于 SPOT 完全由合成 DNA 分子构建，避免了对于昂贵蛋白质酶的需求，具备较好的成本优势。
实验显示，一次 SPOT 测定的材料成本，大约低至 0.02 美元，明显低于已有的检测体系。
与现有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶标测定相比，这种灵敏且特异的分析性能、一步法的操作方案、低成本的优势、以及和 POCT 能力的结合，让 SPOT 能够成为一种更好的测定方法。
未来在检验医学领域，该团队希望利用 SPOT 体系针对循环体内核酸进行检测，实现多类型疾病的灵敏特异分子诊断，从而为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的可能。
进一步地，他们也希望基于核酸适体的结合，能够进行小分子与蛋白的检测，扩展 SPOT 系统在多方面的临床诊断应用。
此前，在体内递送治疗方面，传统的 DNAzyme 不具备可编程的靶向性。而该团队设计的新型 DNAzyme 体系可以快速设计和实现可编程的靶向目标链，并通过切割来达到治疗目标。
总的来说，这一创新有望为疾病治疗提供更精准、更有效的手段，为基因治疗和精准医学的发展带来重要推动。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
那么，本次成果的研发必要性是什么？它弥补了已有测量工具的哪些不足？
据介绍，生物体液（血液、尿液、汗液等）中存在的核酸分子，是对包括癌症和病毒感染等重大疾病进行分子诊断的一类关键生物标志物。
然而，核酸标志物存在低丰度、高度动态、高异质性、背景干扰大等特点，其临床检测面临着测不出、测不准、测不全、测不了、测不起等挑战。
因此，迫切需要开发超灵敏、高特异、通量高、便捷经济的核酸生物标志物检测分析方法。
DNAzymes 是一类体外筛选的合成 DNA 分子，具有类似酶的催化活性，例如裂解核酸磷酸二酯键。
典型的裂解核酸 DNAzyme，由具有催化能力的催化核心、以及用于通过序列互补性识别底物的两条臂组成。
因此，当前许多 DNAzyme 已经广泛用于体外和体内的金属离子检测，因为它们的催化活性高度依赖于金属离子。
然而，具有小分子、蛋白质或核酸检测能力的 DNAzyme 鲜有报道，导致这些目标很难被检测到。
受自然酶和核酸酶的启发，通过实施异构模块（如 aptamer、toehold）来设计异构的 DNAzyme 生物传感器，可以通过小分子、蛋白质、核酸或细菌等，调节因子介导其催化活性。
传统的异构 DNAzyme 生物传感器通常被设计成多组分分子复合体，通过具有 toehold 的抑制链，来抑制并释放 DNAzyme。
以及通过在靶结合后分裂并恢复催化核心，或通过靶诱导的 DNAzyme-底物-靶标复合物的稳定，来实现对于核酸靶的直接检测。
然而，这些生物传感系统对于定向核酸的直接检测，通常表现出皮摩尔至纳摩尔的敏感性，因此无法探测临床样本中的 miRNA 或病毒 RNA 标志物。
而许多 miRNA 被视为是多种癌症的潜在生物标志物，然而由于缺乏癌症诊断的敏感性和特异性，很少有 miRNA 被证明在临床上有用。
王鹏飞认为，这种多组分设计可能会对其检测能力产生负面影响。
由于一些原因比如化学计量的不完善、动力学分子陷阱、催化活性受损、以及信号泄漏的风险增加，会导致低丰度目标更加难以被测量。
而该课题组的主要研究兴趣是：开发简单、快捷、灵敏的新型疾病分子诊断方法。
通过调研，该团队发现体液中的循环核酸已经成为多种疾病的重要液体活检生物标志物。
由于这些核酸生物标志物在生物标本中的高度动态、异质性和低丰度，导致其临床检测面临着巨大挑战。
传统的聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）技术需要严格的样品处理、昂贵仪器和专业操作。
而新型等温扩增方法，比如重组酶聚合酶扩增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）、环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated isothermal amplification）等则能简化操作过程。
而尽管 CRISPR 结合等温扩增技术，能够显示出较高的灵敏度和便捷性，但是存在非特异性扩增、连续操作步骤和对昂贵易损酶的需求等缺陷，限制了临床上的应用。
通过对以上这些因素的思考、并结合课题组自身优势，他们定下了本次课题。
（来源：Angewandte Chemie International Edition）
通过理论模拟与设计，他们设计出了这种新型 DNAzyme 传感器 SPOT。为了明确 SPOT 的机制并优化实验参数，课题组研究了具体的激活方式、以及可应用的核酸靶标长度。
由于 DNAzyme 传感器的自身特性，最初他们设计的 DNAzyme 传感器信号泄漏非常严重，无论如何优化实验条件，都无法达到稳定、高灵敏的检测目的。
通过大量的文献调研，以及学习和理解此前 DNAzyme 传感器的设计原理，再结合组内讨论他们认为：自封锁核酸链的设计，或许可以解决信号泄漏的问题。
后来，通过一系列的实验，信号泄漏问题已经被解决。但是，DNA 酶传感器却无法被激活。
于是，他们进一步优化参数，通过缩短结合臂的长度，最后成功构建了 DNAzyme 传感器。
通过此，他们构造了一个单链、自锁定的单分子系统，并将这种传感系统命名为 SPOT（用于核酸检测的灵敏的环启动 DNAzyme 生物传感器）。
同时，他们进一步将 SPOT 与试纸条结合，为 SPOT 实现 POCT 检测奠定了基础。
经过全面优化和 SPOT 检测，在单管、一步、无预扩增和等温检测的前提下，实现了对 miR-21 的 15fM、对病毒 RNA 的 1.9aM 的强大检测灵敏度，以及对于核酸靶标的检测特异性（区分变异体）。
最终，相关论文以《一种用于核酸敏感检测的可编程 DNAzyme》（A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids）为题发在 Angewandte Chemie International Edition[1]。
史辰致是第一作者，王鹏飞担任通讯作者。
图 | 相关论文（来源：Angewandte Chemie International Edition）
不过，目前只有少量临床样本在 SPOT 上进行测试。未来，课题组将对更多患者进行临床研究，以便全面评估 SPOT 测定的可靠性。
同时，由于本次研究采用了无前置放大器的方案，因此 SPOT 还不够灵敏，无法在肉眼可见的测试条上，产生明显可区分的读数。
因此，该团队打算进一步提高 SPOT 的灵敏度，或与基于等离子体/荧光的便携式可视化设备结合，以便让 SPOT 的 POCT 能力能被用于实际应用。
未来，在临床应用层面，他们希望能够建立多中心、大规模临床队列，对 SPOT 体系的疾病诊断效能进行更大范围的论证。
在技术改进层面，该团队计划拓展 SPOT 的应用范围。除了核酸检测外，他们也希望通过引入核酸适体，来实现对于小分子和蛋白标志物的检测。
参考资料：
1.Shi, C., Yang, D., Ma, X., Pan, L., Shao, Y., Arya, G., ... & Wang, P. (2024). A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids. Angewandte Chemie International Edition, e202320179.
运营/排版：何晨龙
15分钟就能检测新冠病毒！光谱传感器如何做到的？
截止目前，全球累计确诊新冠肺炎超过2258万例，死亡超78万例。
事实并没有像我们期待的那样，夏天的高温也无法阻止疫情蔓延。
尽管国内疫情在严格的防疫政策下逐渐好转，国内人民生活步入正轨，但放眼全球，我们仍然要面对肆意顽固的病毒，出门带上口罩，必要时做核酸检测。
最煎熬的，是等待检测结果的时间。一般而言，核酸检测的过程，少则5、6小时，多则几天。为什么这一过程需要如此长的周期呢？利用光谱检测新冠病毒的方法会更好吗？
核酸检测样本超过72小时就几乎没用
图片源自flickr
当下的新冠病毒核酸检测主要采用聚合酶链反应检测（PCR）方法。 这一方法需要先采取咽拭子样本，然后送到检验医学中心，医务人员依次在试剂准备区接受患者样本，在样本准备区对样本的核酸进行提取，在扩增区扩增复制核酸样本，最后在扩增产物分析区分析样本内核酸能否与标准样本配对，并通过仪器检测结果是否呈阳性。
正是物流和处理步骤的繁杂，致使被检测者从开始检测到拿到检测结果间隔时间较长，这也就意味着，患者在等待结果的这段时间，面临更多感染或被感染的风险。
根据美国中文网的报道，最近CNBC与全球数据和调查公司Dynata合作进行的一项调查显示，将近40%的美国人不得不等待三天以上才能收到新冠病毒检测结果。哈佛大学卫生学教授阿希什·贾哈博士表示，如果检测需要48小时以上，就会失去对被检测者密切接触人的行为追踪，如果时长超过72小时，测试几乎没有用了。
尽管PCR检测方法灵敏度高，在低病毒浓度时就能检测出结果，但是其高成本与长周期的缺点则需要其他检测方法来弥补。
基于光谱传感器，检测时间缩短至15分钟
科学的想象力无限，艾迈斯半导体将光谱传感技术应用到COVID-19检测中，弥补目前PCR检测方法的缺点，可将检测时间缩短至15分钟。
如何将光谱传感器应用COVID-19中？艾迈斯半导体全球先进光学传感器部门的执行副总裁兼总经理Jennifer Zhao介绍，将传统的侧向层析检测（LFT）同专有的光谱传感技术相结合，就能得到专用于检测COVID-19的数字化LFT。
雷锋网了解到，LFT侧向层析技术并不是一项新的技术，该技术是20世纪90年代在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术上发展起来的一项新型体外诊断技术。 它是以微孔滤膜为载体，将特异性抗原或抗体固定在微孔滤膜上，待测样品通过侧向移动和过滤过程中的显色反应，达到自动分离和鉴别的目的。
侧向层析技术在医学检测、食品质量检测、环境检测、农业和畜牧业等领域都有广泛的应用，大多数验孕棒就应用到该技术。具有快速、经济高效的优点，但传统的侧向层析技术是通过肉眼观察读出结果，测试结果不可量化，且灵敏度和准确度同台式实验室测试相比相差较大。
基于艾迈斯半导体光谱传感器的数字化LFT，灵敏度是人眼识别的10倍。 此外，该款LFT检测设备还具有特异性和连接性。其特异性体现在通过组合光谱读出器和适当的生物化学法，选定特定病毒；连接性体现在通过蓝牙模块和获得医学认证的云设备，对全球定量数据进行云采集。
根据艾迈斯的介绍，数字化LFT中用到的光谱解析读出器是产品型号为AS7341L多频道光谱传感器，该传感器共有包括8个涵盖可见光波段的通道、1个涵盖近红外的通道和1个涵盖全光电二极管感光通道，可以实现远超过人眼识别范围的高精度颜色测量。 将读出器置于双线LFT试纸上，借助两个LED进行反射至读出器上，完成对抗体的检测。
艾迈斯半导体光谱传感器支持的数字读出器
因为检测抗原时的C反应蛋白（CRP、炎症标记物）含量低至10pg/ml，所以需要借助UV LED增加检测灵敏度。Jennifer表示，这一款光谱解析读出器在其他领域已经量产且非常成熟，所以非常有信心将其用到COVID-19 LFT测试上。另外，数字化LFT检测COVID-19的准确程度在80%-90%，尽管暂时没有达到台式实验室约90%的准确率，但是符合检测规则标准。
目前，艾迈斯半导体与Senova、Healthcare达成合作，预计在今年9月前提供这款经过医疗产品CE认证的一次性专业检测套件的产量，后续进一步开发提供家用认证设备。
光谱传感器，不止检测COVID-19
近日，我国新冠疫苗研发取得新进展，国药集团董事长刘敬桢表示，国际临床三期试验技术后，灭活疫苗就可以进入审批环节，预计今年12月底能够上市，年产量将超2亿剂。新冠疫苗量产后，基于光谱传感器的数字化LFT还有用武之地吗？
不同阶段的COVID -19检测
尽管COVID-19催生了基于光谱传感器的数字化LFT，但这项技术创新并不局限于检测COVID-19。近期来看，抗体LFT检测可以用于注射疫苗后的抗体检测，帮助使用者确定是否需要再次注射疫苗，长期来看，该项技术也可以检测除了COVID-19之外的病毒或细菌，通过采用与不同的蛋白酶结合并产生光学上的变化，就能检测甲肝、乙肝等其他疾病。
不过，数字化LFT才刚刚起步，艾迈斯半导体推出的应用于检测COVID-19的光谱传感器是一个很好的推动者，当然，也需要更多企业的加入。在LFT数据流方面，也需要更多的云厂商提供支持，实现疫情监控提供共享数据，助力医疗建设。
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