适配体传感器 陈捷陈飘飘联合肝脏外科魏永刚团队：空间位阻调控的酶促反应实现肝细胞癌CTCs的均相双荧光适配体传感

陈捷陈飘飘联合肝脏外科魏永刚团队：空间位阻调控的酶促反应实现肝细胞癌CTCs的均相双荧光适配体传感

四川大学华西医院实验医学科陈捷 /陈飘飘 及肝脏外科魏永刚 团队于2024年6月在Analytical Chemistry发表文章“Steric Hindrance-Mediated Enzymatic Reaction Enable Homogeneous Dual Fluorescence Indicators Aptasensing of Hepatocellular Carcinoma CTCs”（点击二维码阅读原文）。针对目前循环肿瘤细胞检测技术灵敏度不足的问题，该研究构建了一种高灵敏均相双荧光适配体传感器，在空间位阻介导的酶促反应辅助下，可准确定量肝癌循环肿瘤细胞。该方法检测限可达接近单细胞水平，对40例临床患者检测结果显示敏感度和特异性均超过90%。

肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，一般可以通过影像学或组织病理活检进行诊断。然而，这些技术敏感性有限或有侵入性检查的风险，在HCC早期检测和预后评估方面具有局限性。循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤或转移瘤脱落到外周血中的细胞，可作为HCC早期筛查的“液体活检”生物标志物，具有重大前景。然而，由于其含量稀少且具有高度异质性，现有的检测技术在灵敏度方面难以完全满足临床需求，使CTCs的临床应用受到局限。因此，开发一种超灵敏和准确的分析系统来检测HCC患者的CTCs对于提高临床诊疗水平是十分必要的。

该研究的核心是末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），它可催化脱氧核糖核苷酸与单链或双链DNA的3'-OH结合。作者提出假设，通过生物素-链霉亲和素系统修饰，可在双链DNA的5'端形成空间位阻，阻碍其互补链的3'-OH与TdT之间的反应。基于此现象，可开发一种受空间位阻调节的适配体传感器，改变酶促反应产物的量，进而实现目标物的精确定量。该研究选择GPC3阳性CTCs作为目标物，当其与5'-生物素修饰的适配体特异性结合，打开预先形成的双链DNA时，上述空间位阻被解除，并生成焦磷酸盐（PPi）和多胞嘧啶（polyC）链两种酶促反应产物。PPi可与Ce3+反应生成焦磷酸-铈配位聚合物纳米颗粒（PPi-Ce CPNs），而polyC可以特异地猝灭亚甲基蓝（MB）的荧光。通过检测两种信号，可精确定量GPC3阳性CTCs，辅助HCC的早期诊断。这种设计使得TdT的扩增效应得以充分利用，达到了接近单细胞水平的检测限，解决了现有技术分析灵敏度不足的问题。且整个操作流程无需大型仪器，1小时内可完成检测，为HCC的临床诊断提供了实用的新工具。

研究首先使用透射电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳等进行表征，验证了核心原理的可行性。然后，通过一系列优化确定最佳反应条件，构建GPC3蛋白和HepG2细胞的标准曲线。最后，收集临床全血样本进行分析，验证该方法的诊断效能。

该研究结合团队前期的CTCs分离技术和空间位阻调控酶促反应的现象，成功建立了CTCs的均相双荧光适配体传感器（图1）。对40例临床样本进行检测，发现该方法可以有效区分HCC患者和健康人，且测试结果和临床CT及病理学结果具有高度一致性（图2）。

图1 　（a） CTCs的分离和富集（b）HCC患者GPC3阳性CTCs的双荧光分析

图2　临床样本分析的流程和结果以及HCC患者的影像学、病理学诊断资料

专家点评

林苹研究员 ：肝细胞癌是一种恶性程度高、预后较差的肿瘤。早期筛查并积极治疗有利于改善疾病的预后，提高患者生存率。2021年，中华医学会检验医学分会分子诊断学组发布了《循环肿瘤细胞临床应用与实验室检测专家共识》，这标志CTCs检测进入临床普及阶段，并且拥有系统规范的行业专家指导共识。四川大学华西医院实验医学科陈捷/陈飘飘联合肝脏外科魏永刚研究团队着眼于现有CTCs检测方法灵敏度不足、操作复杂等技术痛点，应用独特的空间位阻调控TdT酶促反应的现象，开发了针对肝细胞癌CTCs的高灵敏均相双荧光检测技术，设计简单且新颖，分析性能良好。并且，在真实临床样本中进行验证也显示该检测技术诊断效能优异，结果与金标准方法具有一致性。该团队的此项研究成果为后续实践和转化奠定基础，具有广阔的应用前景和重要的临床价值。

林苹 ，研究员，博士生导师，四川大学华西医院实验肿瘤研究室主任。中国细胞生物学学会理事。致力于肿瘤和慢性炎症疾病发病机制的研究。开展基因转录调控、蛋白及蛋白翻译后修饰在肿瘤中的生物学功能研究，以及核酸适配体及多肽在肿瘤诊断治疗中的应用技术研究。负责国家自然基金项目6项、国际合作项目1项，省部级科学研究基金6项。发表论著80余篇，包括在Signal Transduct Target Ther、J Allergy Clin Immuno、 Sens Actuators, B 等高质量期刊发表SCI论文40余篇。获得2014中华医学科技进步一等奖、2011年四川省科技进步一等奖。

作者心得

CTCs存在于约80%的早期肝癌患者外周血中，是肿瘤早期发现的重要指标，为预警肿瘤发生、提早制定治疗计划提供依据。然而， CTCs分离和检测的技术存在阳性率低、灵敏度不足等问题，且现有的分析方法多数操作复杂，依赖专业人员或设备，使得临床研究难以推进。针对上述需求，团队设计了一种由空间位阻调控改变酶促反应产物生成量，进而实现目标物精确定量的核酸适配体传感器。相比于传统方法，该方法具有灵敏度高、成本低、操作简单快速、样品需求量小等优势，这也是本文得以成功发表的重要原因。另一方面，尽管本研究目前以GPC3阳性CTCs为例获得了较好的实验成果，但仅检测一种生物标志物，对于具有高度异质性的肿瘤细胞可能存在漏检。因此，未来的工作将集中于开发多目标同时传感系统，为HCC患者提供更实用而有价值的诊断选择。

本文发表于化学领域知名期刊Analytical Chemistry，Nature Index收录，最新影响因子6.7，位于JCR学科类别“CHEMISTRY, ANALYTICAL”的Q1区。该期刊是分析化学领域被引用次数最多的同行评审期刊，发表分析化学所有分支中的新认知和原创工作。期刊对论文的创新性、科学性及完整性有较高要求，文章投稿近1个月收到一审重投意见，2位审稿专家及期刊副主编对文章工作给予了积极评价，同时提出了许多严格的、建设性的意见，为文章的质量提升提供了宝贵的机会，主要包括对所有图片进行重新绘制及其相关描述的优化等。作者在约1个月返修完毕后，收到二审大修意见，4位审稿专家再次提出了多条专业的意见，主要为继续补充多项对于核心现象的验证实验和材料表征试验等。作者耗时1个月补充实验及优化论文结构，并逐条认真回复审稿专家的意见。论文最终在1个月后得到了所有审稿专家的认可，总共经历2次返修、耗时近5月后被接收发表。

通信作者

陈捷 ，临床检验诊断学博士，主任技师，博士生导师，四川大学华西医院实验医学科党支部书记兼副主任。四川省学术和技术带头人后备人选，四川省卫健委学术带头人。中国医院协会临床检验专委会委员，中国中西医结合学会检验专委会常委，四川省医学会检验专委会常委，四川省医师协会检验医师分会常委。主要从事临床免疫调节机制及创新标志物和检测技术研究，主持国家自然科学基金课题3项、科技部重点研发课题2项，四川省卫生厅课题1项，参与国家及省部级课题10余项。副主编专著2部，参编专著、教材8部。在Biosens Bioelectron、ACS Appl Mater Interfaces、J Mater Chem、Eur J Cancer、J Autoimmun 等期刊发表论文30余篇。获多项发明专利，以第一完成人获四川省医学青年科技奖一等奖。

共同通信作者

陈飘飘 ，分析化学博士，医学博士后，副研究员，硕士生导师，四川大学华西医院实验医学科专职科研，四川大学“医学+制造”中心PI。Research、Exploration 和Interdisciplinary Medicine 期刊青年编委。聚焦“临床分子诊断和便携式医学检验装备”领域，主持国家自然科学基金等项目7项。在Adv Sci、ACS Nano、Nano Lett、Research、Anal Chem、Food Chem、Biosens Bioelectron 等期刊发表SCI论文60余篇（IF>10论文11篇）；受理/授权第一发明人国家发明专利25项。获四川省医学青年科技奖应用研究类一等奖、华西医工十大进展-探索类、第九届华西青年榜样等荣誉。

共同通信作者

魏永刚 ，博士，主任医师，硕士生导师，四川大学华西医院肝脏外科病房副主任。现任中国医师协会器官移植分会委员，中华医学会器官移植分会青年委员，中国医促会肝移植分会委员，海峡两岸医学交流促进会移植分会委员，海峡两岸医学交流促进会肝胆胰分会委员，四川省抗癌协会肝癌专业委员会副主任委员，四川省医学创新委员会肝胆胰分会副主任委员，四川省医疗卫生健康促进会肝胆胰外科专委会副主任委员，四川省临床移植免疫分会常委等。主要研究方向集中于肝脏微创的技术创新、肝癌的系统治疗、肝癌发生的分子机制等方面。长期从事肝脏微创及肝移植工作，年完成腹腔镜肝切除近300例，肝癌切除200例。在腹腔镜肝切除相关领域累计发表SCI论文50余篇。

第一作者

蒋鹏骏 ，四川大学华西医院/四川大学华西临床医学院临床检验学诊断学博士研究生。现主要研究方向为肿瘤的临床分子诊断新技术。以第一作者/共同第一作者在Anal Chem、Sens Actuators, B、ACS Appl Mater Interfaces 等期刊发表SCI论文5篇。

来源：华西医学时间

裴仁军陆艺郭子建Chem Sci：光调控的适配体传感器用于实时监测活细胞线粒体内ATP的变化

荧光适配体传感器在用于小分子代谢物的细胞内成像方面具有良好的应用潜力。这类代谢物在不同亚细胞位置上的分布往往不同，其浓度和位置也会随时间波动，因此对这些代谢物进行时空控制监测的难度也很大。

有鉴于此，中科院苏州纳米所裴仁军研究员、伊利诺伊大学香槟分校陆艺教授和南京大学郭子建院士 合作报道了一种可被光调控的功能化适配体传感器。

本文要点

该传感器能够利用修饰的DQAsomes去靶向线粒体，进而可对活细胞线粒体内的ATP进行时空监测。由于具有光调控的性能，该适配体传感器在到达线粒体之前不会被激活，而在光的照射下则会激活其传感性能。

研究表明，该传感器的检测限为3.7 mM，并具有高选择性，可以检测由Ca2+或寡霉素诱导产生的线粒体内ATP浓度变化。

Shanni Hong, Zijian Guo, Renjun Pei, Yi Lu. et al. A photo-regulated aptamer sensor for spatiotemporally controlled monitoring of ATP in the mitochondria of living cells. Chemical Science. 2019

DOI:10.1039/C9SC04773E

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/c9sc04773e#!divAbstract

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